Problemy z PCR

[Gość: Tomasz]

Mam ostatnio problemy z PCR. Robię go na matrycach pochodzących z bakterii
brodawkowych (Bradyrhizobium). Amplifikuje geny nod (nodulacji). Jeden z
primerów zawodzi w sekwencjonowaniu. Na tej samej matrycy (ilosć DNA
i ten sam preparat) jeden z primerów daje bardzo dobre reakcje sekwencyjne,
a drugi często zawodzi, mimo że sewkencja wskazuje na obecnosć miejsca,
gdzie się on powinien przyczepić.
Podejrzewam, że przyczyną może być degradacja primera, który jest już dosć
stary. Chociaż jak wyjasnic, że niektore reakcje wychodzą bardzo dobrze?

[Gość: kpsting]

Osobiscie nie sekwencjonowalem nigdy z bakteryjnego DNA ale ja bym na poczatek
poeksperymentowal z iloscia matrycy w reakcji, poniewaz to jest podstawowa
rzecz ktora ma wplyw na jakosc sekwencjonowania. Jesli jedne reakcje z tym
samym primerem wychodza a inne nie to stawialbym, ze jest problem z matryca

[true_blue]

Wszystko zalezy jak sekwencjonowanie wyglada: czy nie ma w ogole sygnalu (moze
temperatura za wysoka), czy sygnal "podwojny" (primer lapie sie
niespecyficznie, moze temperatura za niska?). Ja tez pobawilabym sie troche z
matryca, albo moze zaprojektowala inny primer uzywajac jakiegos porzadnego
programu (Clone Manager).
Pozdr.

[Gość: Tomasz]

Dzięki za komentarze. Primer ma wyższą temperaturę anilingu o ponad 10 stopni C od
używanej przy sekwencjonowaniu. Jednak podniesienie temperatury sekwencjinowania do
maksymalnej (60 C), także nie przyniosło efektów.
Ilosć matrycy była użyta taka sama jak w reakcji z innym primerem, ktora wyszla idealnie.
Elektroforogram wskazuje jednak na problemy z reakcją sekwencyjną.
Podejrzewam że mogło dojsc do częsciowej degradacji primera, który jest dosć stary.
To jest jedyne wytłumaczenie. Primer jest zdegenerowany. Ponieważ reakcje zachodzą
częsciej na pewnych matrycach, może to być wynikiem braku pewnych wariantów,
pasujących do niektórych matryc. W każdym bądź razie użyje nowego primera.

[true_blue]

Szczerze mowiac nie chcialabym sekwencjonowac moich sekwencji primerem
zdegenerowanym :-) To pierwszy krok do niespecyficznych sygnalow, a do tego,
jesli zdegradowal, to mas mieszanke primerow roznej dlugosci i roznej
sekwencji... jak to w ogole mozliwe, zeby sekwencjonowal dobrze?
Co do ilosci matrycy przy sekwencjonowaniu drugim primerem to ja bym tak
pochopnie nie porownywala. Przeciez wszystko zalezy od stosunku stezen
matryca/primer. A do tego od temperatur itp.
Zycze powodzenia z nowym primerem (moze juz nie zdegenerowanym?).
Pozdr.

[Gość: Tomasz]

Używam primerów zdegenerowanych zarówno do PCR jak i sekwencjonowania.
Degeneracja nie dotyczy jednak długosci primera. Sekwencje jakie uzyskuję są
zwykle bardzo dobre- mogę z łatwoscią zczytać 500-700 bp.

[Gość: Tomasz]

Primery w PCR i reakcjach sekwencyjnych występują zwykle w dużym nadmiarze
w stosunku do matrycy. Zwiększenie ilosci z 3 pM na reakcję sekwencyjną
do np. 50 pM nie powoduje (poza większym użyciem primera) skutków ubocznych.

Mój projekt polega na sekwencjonowaniu genów nodulacji, których sekwencje są bardzo różnorodne.
To nie jest to samo co 16S rDNA. Dlatego uzywanie zdegenerowanych primerów jest
koniecznoscią. A jaka jest jakosć sekwencji - musiałabys zobaczyć.

[true_blue]

Wierze Ci. Czy robienie tych doswiadczen primerami zdegenerowanymi to efekt
oszczednosci? Swoja droga, wiem co to znaczy "primery zdegenerowane", a w moim
poprzednim poscie gdy mowilam o roznych dlugosciach primerow odnosilam sie do
mozliwosci, ze primery sa zdeGradowane.
Powodzenia.

[Gość: Tomasz]

Używanie takich primerów to oczywiscie efekt oszczędnosci, ale także
koniecznosci. Sekwencjonuję gen nodA, który nie jest tak konserwatywny
jak np. dnaK. W obrębie rodzaju Bradyrhizobium, którym się zajmuję różnice
sekwencji sięgają 50%. W istocie porównanie sekwencji pokazuje że tylko
nieliczne pozycje są zachowane. Na tym polega sztuka amplifikacji i sekwencjonowania
tych genów. Wkrótce będzie dostępna "on-line" nasza praca na ten temat w
"Molecular Phylogenetics and Evolution". W druku ukaże się dopiero w marcu.

[true_blue]

Super. Bede sledzic. To jest bardzo ciekawe, ze gen nie jest konserwowany na
poziome DNA. Bo na poziome bialka jest? Na co najczesciej wplywaja mutacje? I
czy sa jakies regiony, ktore sa znacznie bardziej konserwowane? Mysle, ze
poczekam na publikacje i sobie przeczytam z przyjemnoscia.
Pozdr.

[Gość: Tomasz]

Zmienne są także sekwencje aminokwasowe. Jest to bardzo "dynamiczny"
gen, co jest wynikiem tego że jest to "młody" gen- symbioza pomiędzy rhizobiami
a roslinami motylkowatymi rozwinęła się około 60 mln lat temu. W porównaniu
z taką nitrogenazą, która ma ponad 3 mld lat jest to bardzo niewiele. "Młode" geny
ulegają zazwyczaj szybszej ewolucji niż stare.

[true_blue]

A geny gospodarza tez mutuja? A wlasciwie inaczej: czy widac jakas zaleznosc
miedzy gospodarzami, a bakteriami w regionach mutacji? Macie jakis model? No
naprawde chetnie zajrze do artykulu. Mozesz podac mi nazwisko profesora, albo
swoje, zebym mogla latwo szukac? Mozesz mi przeslac na priv. :-)
Pozdr.

[Gość: Tomasz]

To jest bardzo trudne pytanie. Przede wszystkim filogeneza roslin oparta jest
na "uniwersalnych" markerach. Ponadto bardzo niewiele jeszcze wiadomo
nt. genów roslinnych, ktore są zaagażowane w proces symbiozy, a szczególnie
w proces rozpoznania rhizobium.
Przypuszcza sie ze moze istniec pewne podobienstwo drzew filogenetycznych
genow nod i markerow roslinnych.