biotechnologiczna sprawa

[advancer]

Witam,
z koleżanką mamy zamiar zająć się izolacją wirusów występujących w żywności,
tak oto wyglada z grubsza metodyka + garść problemów na które się natknęliśmy:
1.I etap izolacji - pojawia sie tu polimer o nazwie Cat-Floc T, niestety niby
powinien istniec w ofercie firmy Calgon Corp., ale coś go tam znaleźć nie mogę
- czy ktoś z Państwa uzywal moze Cat-Floc'a w swoich pracach i moglby mi
wskazac dystrybutora lub producenta. Poki co czekam na odpowiedz firmy Calgon
2.II etap izolacji - za pomocą kita (niezgrabne spolszczenie) do izolacji
wirusów z żywności - jestem ciekaw czy znajdzie sie tu ktos kto uzywal
dobrego, taniego kita, ktory moze polecic
3.Reakcja RT-PCR z uzyciem zestawu "RevertAid.." . Oczywiście oparta o losowe
heksamery. Po etapie RT dodam polimerazy (czy cos jesczze musze dodawac zeby
ruszyl wlasciwy PCR?) i licze ze uzyskam probowke pelna kopii interesujacego
mnie RNA wirusowego i wszelkich innych nieinteresujacych mnie produktow
(oczywiscie w pstaci cDNA)
4.Reakcja PCR z uzyciem specyficznych primerów na 1 mikrolitrze matrycy
uzyskanym w wyniku RT-PCR - dzieki czemu jedna probke z RT bede mogl sprawdzic
na obecnosc wielu wirusow (zaoszczedze na kicie do RT, ktory jest drogi)

Bardzo prosze o opinie

[koliber123]

Niestety wydaje mi sie ze najpierw musisz solidnie przestudiowac swoja
metodyke , zasady reakcji PCR, warunki jej optymalizacji itd. zanim zabierzesz
sie do pracy...Czy naprawde uwazasz ze masz wystarczajce pojecie o tym co
chcesz robic? Twoj post wydaje mi sie zlepkiem jakichs dziwnych informacji...a
naprawde szkoda kasy i czasu jesli nie bardzo wiesz czym sie to je..

Nie izoluje nic z wirusow eic pierwszy etap twojej metodyki jest mi obcy. Ale
za to zasady reakcji PCR sa z grubsza jednakowe dla kazdego ttpu reakcji wiec
znalez cinformacje chocby w necie jak sie to robi nie jest trudno.

Do etapyu izolacji stosuje sie najczesciej kity roznych firm, np. Applied
Biosystems, Sigma, Roche, itd itd....jest tego multum.....trzeba poszukac w
ofercie.

Co do tego CO MASZ DODAC do polimerazy w reakcji PCR to jest oczywiste ze (o
ile twoj kit tego nie zawiera, nie wiem..) musisz dodac primery, bufor, magnez,
dNTP, itd..czyli to co w zwyklej reakcji PCR. Inaczej Ci nie ruszty reakcja.

Czy w zadnej publikacji nie ma przepisu na PCR ktory chcesz robic? Jezeli Ty
dopiero opracowujesz metodyke, jako pierwsza osoba na swiecie to niestety
musisz sie tym troche pobawic.....Po prostu zoptymalizowac technike dla swoich
warunkow... I tyle.

[advancer]

kit zawiera juz wszystko, wystarczy dodac plimeraze
z procedura jest problem poniewaz badania maja dotyczyc wielu rodzajow wirusow -
niestety pojedyncze prace dotycza przewaznie tylko jednego. Ponadto co autor to
pomysl. Staram sie polaczyc kilka koncepcji w najbardziej wydajna, najszybsza i
najtansza.
wiecej informacji zamiescilem nieco nizej

[koliber123]

Sprawa jest prosta..jesli bedziesz miec juz cDNA to nawet w jednej probowce
mozesz badac kilka sekwencji w reakcji PCR. Takie mozliwosc daja najnowsze
urzadzenia do Real time PCR gdzie wykorzystujac odpowiednie sondy
fluorescencyjne i odpowiednio zaprojektowane primery mozna badac ekspresje i
jej poziom odnosnie kilku genow w czasie jednego PCR....wtedy odpadaja wszelkie
prazki na zelu itp. choc w etapie optymalizowania metody wskazane jest
sprawdzenie czy primery ktore posiadamy amplifikuja sekwencje o ktora nam
chodzi, a to najlepiej sprawdzic wlasnie na zelu..i tu powrot do poczataku
musisz wiedziec jaka sekwencje chcesz powielac!!

Co do zawartosci kitu do odwrotnej transkrypcji i PCR to zgadzam sie z Tlenkiem
wegla ze przed przystapieniem do etapu PCR nalezaloby dokladnie sprawdzic
zawartosc nukleotydow...wszak to substrat dla polimerazy.

[tlenek_wegla]

Kilka uwag.

Piopieram to co powiedzial koliber. Najpier radze przeszukanie literatury pod
katem wlasnych badan. Izolowanie wirusow z zywnosci to nie nowosc - istnieje
cala masa literatury i manuali dotyczacych, zarowno samej izolacji wirusow, jak
i PCR (zwlaszcza PCR)
troche tutjaj:
www.mcb.uct.ac.za/manual/pcr.htm
...i tutaj:
www.protocol-online.org/
Co do samego roblemu. Nie zabieralbym sie za kupowanie odczynnikow przed
ukonczeniem projektowania calego eksperymentu. Strata pieniedzy. Najpierw
przeanalizuj kilka podstawowych kwestii:
- co chce uzyskac
- jakim materialem dysponuje i w jakiej ilosci
- co doradza literatura, osoby z doswiadczeniem (rodzaj procedury, odczynnikow
itp)
- jezeli material posiada jakies charakterystyczne cechy, to jak moze to
wplynac na odczynniki, ktore poleca literatura lub osoby majace doswiadczenie
(przeciwutleniacze, inne substancje konserwujace)
- jak odczynniki z jednego etapu wplyna na kolejny etap - PCR
- jakie sa moje ograniczenia finansowe ( to chyba dosyc istotne)

Ad 1
Nie ma sensu upierac sie na zwiazek, ktory moze byc w Polsce niedostepny. Nie
wiem jak to jest z Cat-Floc T, ale z tego co wyczytalem nie wszedzie to
sprzedaja. Moze rozejrzysz sie na rynku za innym flokulantem (jezeli tak to
brzmi po polsku). Szukasz czegos, co umozliwi agregacje czasteczek wirusow i
przeniesie je do latwo izolowanej fazy. Warto poczytac na ten temat i
dowiedziec sie co moze byc stosowane w zamian.

Ad 2
Jezeli chcesz izolowac za pomoca gotowego zestawu, to po co Ci dodatkowe
odczynniki do izolacji? Skoro jednostka zapewnia pieniadze na kit, to radze
wybrac nie najtanszy, a taki ktory pozwoli zrealizowac cel. Moze byc drozszy
ale zawierac wszystko co niezbedne do kompletnej izolacji. W takim wypadku
zmniejsza sie tez ryzyko pomylki. Gotowa procedura i dobrane dobrze
odczynniki...

Ad 3
Radze wczytac sie w manual do ReverAid.
www.fermentas.com/profiles/kits/pdf/revertaidhminus1631.pdf
www.fermentas.com/profiles/kits/pdf/revertaidhminus1632.pdf
Oczywiscie, ze losowe primery. Producent nie zapewnia innych. Warto sie
zastanowic, czy losowe sa wystarczajaco dobre dla Ciebie. Moze bedzie trzeba
zamowic wlasne - dostosowane do wirusa (jezeli szukasz konkretnego); Co jesli
interesujacy Cie wirus jest RNA wirusem, co jesli integruje w postaci DNA, co
jesli...radze wrocic do poczatku i poczytac o zagadnieniu wiecej...

Nie liczylbym na probowke pelna kopii RNA. prosze nie pisz takich bzdur. RT-PCR
ma na celu przepisanie informacji z matrycy RNA na DNA i powielenie jej. Jezeli
wiesz jaki kit chcesz stosowac, to to przynajmniej przeczytaj do czego on
jest!! po prawidlowym rozpoczeciu reakcji uzyskujesz produkt w postaci cDNA
(transkrypt mRNA).

Kolejne pytanie. co jesli to transkrypt RNA z zywnosci, nie wirusa?? Moze warto
zastanowic sie nad bardziej specyficznymi primerami niz losowe sekwencje
szescionukleotydowe. W ten sposob uzyskasz wieksza pewnosc, ze w probowcze jest
wlasciwa sekwencja "cDNA" Powrot do poczatku - jakie wyniki chcesz uzyskac?
Ineteresuja Cie wszystkie produkty RNA w probce?? Wtedy polecam CHIP-DNA i
zabawe mikromacierzami. Troche kosztowne;

Ad 4
Dodatkowo poczytaj o samym PCR; Warto poznac temat zanim zacznie sie cos na tym
polu robic. PCR to nie tylko polimeraza.

Zanim zaczniesz eksperyment przeczytaj przynajmniej jedna ksiazke do biologii
molekularnej!

Pozdrawiam.

[tlenek_wegla]

Chyba nie doczytalem. Wiesz, ze uzuskasz cDNA wirusa i mase innych produktow.
Dlatego pozwole sobie jeszcze raz zapytac. Co z zastosowaniem specyficznych
primerow. Skoro wiesz czego szukasz izoluj specyficznie. jak juz raz uzyskasz
matryce nic nie stoi na przeszkodzie, zeby ja powielic n razy klasycznym PCR w
miare potrzeb.

[advancer]

dziekuje, niektore rady moga okazac sie pozyteczne
niestey jak widze w wielu przypadkach zostalem zle zrozumiany, glownie ze
wzgledu na moje niedopowiedzenia. Doskonale wiem co to PCR, dodatek samej
polimerazy ma sens poniewaz w kicie uzywanym chwile wczesniej znajduja sie
wszystkie niezbedne skladniki reakcji i po prostu taka procedure juz gdzies
widzialem.
Dodatkowe odczynniki do izolacji sa mi potrzebne poniewaz nie wymyslono jeszcze
kitow, ktore wyizoluja mi wirusa z materialu nazwijmy to "trudnego" ..tak jak
trafnie zostalo to zauwazone chce go w pierwszym etapie izolacji przeniesc do
osrodka plynnego, wolnego od komorek, z ktorego to bede juz izolowal za pomoca kitu.
dodatkowo wirusy beda izolowane z roznych miejsc i optymalizuje procedure pod
kontem uniwersalizacji zastosowania + jak wiadomo, koszty
o cDNA, specyficznych primerach napisalem - az takich dziur nie mam..
moze pokarze na schemacie moj zamysl, bo nie bardzo wiem jak w kilku slowach
strescic cos takiego:
ogólne RNA -RT->ogólne cDNA-PCR->wiele kopii ogólnego cDNA-PCR i specyficzne
primery->prazek na zelu->radosc - znalazlem norowirusa, rota, astro itp...
dziekuje za przydatne adresy,kiedys tam zagladalem ale wyparowalo

Fakt trudno jest

[tlenek_wegla]

Rzeczywiscie chyba zbyt szybko przeskoczylem do krytyki.

Jezeli chodzi o dodanie polimerazy - moze sie udac, tylko pozostaje kilka ale.
Samych dNTP musialbys dodac do pierwszej reakcji w nadmiarze tak, aby starczylo
na klasyczny PCR. Nie wiem jak wplyneloby to na reakcje pierwotna.
jezeli przewidujesz etap zastopowania reakcji i dodania polimerazy, moze warto
w tym momencie uzupelnic nukleotydow. Reszta powiadasz jest w buforze do RT-PCR
(lepiej sprawdzic dokladnie co w tym kicie zapewniaja)


Ale jesli chodzi o ogolna ekspresje - moze jednak mikromacierze?

Wszystko zalezy od ukladu doswiadczenia. To co opisujesz to prawdziwa
pionierska zabawa, tylko teraz juz tak sie nie robi...